国产MIRA替代新一代等温扩增检测技术RPA

近期,学术期刊连发两篇论文,上半年引爆生物圈的华人科学家张锋教授团队又有新动作!这次,他在一月内,分别在《Nature》、《Science》连发两篇论文!他将CRISPR-Cas13a改造成了灵敏度达到了阿摩尔级(aM,10的负18次方摩尔每升),可以检测单分子的SHERLOCK技术。而这其中,RPA起到了不小的作用。

RPA,即重组酶聚合酶扩增技术,是在由多种酶和蛋白的参与下,在恒温条件下实现核酸指数扩增的技术,被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。是英国TwistDx公司开发的,该公司通过突破等温DNA扩增,开发的重组酶聚合酶扩增zhuan利技术(RPA),被誉为DNA诊断领域的革命性创新。

安普未来生物科技有限公司经过十年技术沉淀,以代表未来技术趋势的多酶恒温快速扩增技术,MIRA(Multienzyme Isothermal Rapid Amplification, MIRA)。

MIRA(Multienzyme Isothermal Rapid Amplification, MIRA)技术是一种多酶恒温核酸快速扩增技术,基本原理是:在常温恒温下,重组酶和引物形成蛋白/单链核苷酸的复合体 Rec/ssDNA,在辅助蛋白和单链结合蛋白 SSB 的帮助下,侵入双链 DNA 模板;在侵入位点形成 D-loop 区域,并开始对 DNA 双链进行扫描;待找到与引物互补的目的区域后,复合体 Rec/ssDNA 解体的同时,聚合酶也结合到引物的 3’末端,开始链的延伸,这个过程迅速高效地循环,从而完成目的片段超快速扩增。

荧光检测则依赖核酸外切酶的作用,加入根据模版设计的特异的分子探针,使用荧光监测设备实现对目标片段扩增过程的实时监控。

国产MIRA替代新一代等温扩增检测技术RPA

图1 MIRA技术原理

 

★引物设计

建议使用长度在 30-35bp 的引物,引物过长或过短会影响扩增速度和检测灵敏度(特殊情况下设计较长

引物比较困难的序列,引物长度可缩短至 25 bp,但不少于 25 bp);引物序列要求:

1.碱基排布随机性高,GC 含量在 30%-70%之间;

2.扩增片段避免形成二级结构而影响扩增;

3.扩增片段长度建议在 150-300 bp,通常不超过 500 bp。

★荧光探针设计

在上下游引物中间,设计一段长度为 46-52nt 与目的片段互补的序列作为荧光探针;探针序列不与特异

性引物识别位点重叠,长度为 46-52 nt,序列避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基。探针共有四

个修饰位点:

1.距离 5’端的 30-35 nt 的中部位置标记一个 dSpacer(THF),作为核酸外切酶的识别位点 (任

何碱基,无特殊要求) ;

2.THF 位点的上游的 T 碱基上标记一个荧光基团(如 FAM),下游在 T 碱基上标记一个淬灭基团(如

BHQ1),两个基团的间距为 2-4 nt;

3.THF 距离 3’末端约 15 nt,并且 3’末端标记一个修饰基团,例如胺基、磷酸基团或 C3-spacer。

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图2 荧光探针原理

4.探针示例:

探针序列:

5’-ATGGCTATCATATCGCATAACTGCCGACAGTAGCTCTCAAAGATGGACC-3’

30-35nt                                ≥15nt

探针修饰:

ATGGCTATCATATCGCATAACTGCCGACAG[FAM-dT]AG[THF][BHQ-dT]CTCAAAGATGGACC-3’C3spacer。

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