DNA(液体胶体金试纸条型)恒温快速扩增试剂盒

(货号:WLN5002

订购可在线咨询,或者直接联系:13911291885(同微信号),QQ:2208618493 DNA(液体胶体金试纸条型)恒温快速扩增试剂盒

原理概述:

本试剂盒基于一种常温恒温核酸快速扩增技术:在常温恒温下,重组酶和引物形成蛋白/单链核苷酸的复合体Rec/ssDNA,在辅助蛋白和单链结合蛋白SSB的帮助下,侵入双链DNA模板;在侵入位点形成D-loop区域,并开始对DNA双链进行扫描;待找到与引物互补的目的区域后,复合体Rec/ssDNA解体的同时,聚合酶也结合到引物的3’末端,开始链的延伸。依赖nfo酶的作用,加入根据模板设计的特异的分子探针,使用胶体金技术(三明治夹心法)可以对最终结果进行检测。

引物设计:

建议使用长度在 30-35 bp的引物,引物过短会影响扩增速度和检测灵敏度;下游引物的5’端标记一个修饰基团(常用生物素)。引物设计避免形成二级结构而影响扩增;扩增子长度建议在150-300 bp,通常不超过500 bp。

探针设计:

探针序列不与特异性引物识别位点重叠,长度为46-52 nt,序列避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基。探针共有三个修饰位点:5’端修饰一个抗原标记(典型FAM);在5’端和3’末端的中部位置标记一个dSpacer(四氢呋喃,THF),作为nfo的识别位点;3’末端标记一个修饰基团,例如胺基、磷酸基团或C3-Spacer等。

试剂盒组成:

   100T/盒

组成 含量
C buffer 1 mL×2管
L buffer 500 μL×1管
P-core 1.2 mL×1管
N-core 60 μL×1管
B buffer 300 μL×1管
使用说明书 1份

试剂盒储存:

运输条件:低温运输;

储存条件:储存温度 ≤ -20 ºC,避光保存,避免重压、反复冻融;

产品有效期:6个月

操作步骤:提前将试剂盒所需组分取出,冰上或低温下融化(C buffer可室温融化),震荡混匀

1) 向无菌0.2mL PCR管中加入20 μL C buffer、5 μL L buffer;

2) 加入2 μL上游引物、2 μL下游引物和0.6 μL探针,再加入1.5μL dNTPs(10 mM);

3) 向反应管中加入12 μL P-core和0.6 μLN-core,(步骤1~3可以混合后再分装至反应管中);

4) 向反应管中加入3.8 μL核酸模板;

5) 最后向反应管中加入2.5 μL B buffer并充分混合(请务必上下颠倒甩动反应管8-10次进行混匀;对于多个反应,建议提前将B buffer加至反应管的盖子内侧,盖上盖后上下颠倒后混匀);混匀后,将反应液甩(或快速离心)至管子底部,然后立即将反应管放入恒温设备中39 ºC孵育8-12 min。

6) 反应结束后,取10 μL加入含有190 μL ddH2O的离心管中,混合均匀后,将胶体金试纸条的样品端插入离心管中平衡,5 min内观察质控线与检测线判读结果。

体系配制

组分 体积(μL)
C buffer 20

5

L buffer
P-core 12
N-core 0.6
dNTPs(10 mM) 1.5
上游引物(10 μM) 2
下游引物(10 μM) 2
探针(10 μM) 0.6
核酸模板 3.8
B buffer 2.5
总体积 50

 

N:阴性对照; P:正对照

注意事项:

  • 为保证液体试剂组分活性,请保证储存温度 ≤ -20 ºC;试剂使用时请保持低温,避免高温放置过长时间;

在进行反应时请注意避免微量核酸染,并设置空白对照实验组。

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