荧光型RNA恒温快速扩增试剂盒

(货号:WLRE8205KIT

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原理概述:

本试剂盒基于一种常温恒温核酸快速扩增技术:在常温恒温下,特殊修饰的反转录酶利用特异性引物DNA和模板RNA合成cDNA链,反应体系中的重组酶、单链DNA结合蛋白和DNA聚合酶以新合成的cDNA链为模板进行快速核酸扩增反应。本试剂盒在42 ºC下,依赖核酸外切酶的作用,加入根据模版设计的特异的分子探针,使用荧光监测设备能实现对目标片段扩增过程的实时监控。适用于实验室级别的RNA扩增以及其他检测用途的RNA扩增使用。

产品特点:

本试剂盒具有灵敏度高、特异性强、反应时间短(仅需20 mins)等优点,反应组分为干粉状态,操作简便,易于保存。

可适用于各种品牌的荧光定量PCR仪,恒温荧光扩增仪器等荧光检测设备。

引物设计:

建议使用长度在 30-35 bp的引物,引物过短会影响扩增速度和检测灵敏度;引物设计避免形成二级结构而影响扩增;扩增子长度建议在150-300 bp,通常不超过500 bp。

荧光探针设计:

探针序列不与特异性引物识别位点重叠,长度为46-52 nt,序列避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基。探针共有四个修饰位点:距离5’端的≥35 nt的中部位置标记一个dSpacer(四氢呋喃,THF),作为核酸外切酶的识别位点;THF位点的上游标记一个荧光基团,下游标记一个粹灭基团,两个基团的间距为2-4 nt;THF距离3’末端≥15 nt,并且3’末端标记一个修饰基团,例如胺基、磷酸基团或C3-spacer。

试剂盒组成:

组成 含量
A Buffer 1.6 mL×1管
B Buffer 150 μL×1管
试剂 48份
使用说明书 1份

试剂盒储存:

运输条件:低温运输;

储存条件:储存温度 ≤ -20 ºC,避光保存,避免重压、反复冻融;

产品有效期:12个月。

 

操作步骤:提前30分钟将试剂盒所需组分取出,室温融化,震荡混匀。

1)    每个干粉反应管加入29.4 μL A buffer(注意:A buffer需完全融化混匀,否则会对实验效果产生影响);

2)    每个反应管分别加入2 μL上游引物、2 μL下游引物和0.6 μL探针(引物和探针浓度为10 μM,对于多个反应、步骤1和步骤2可以混合后再分装至反应管中);

3)    向反应管中依次加入11.5 μL ddH2O和2 μL核酸模板(可根据核酸浓度调整加入的核酸模板体积,并相应调整加入的ddH2O体积,至模板与ddH2O总体积为13.5 μL);

4)    最后向反应管中加入2.5 μL B Buffer并充分混合(对于多个反应,建议将B Buffer加至反应管的盖子内侧,上下颠倒反应管8-10次混匀);

5)    混匀后,将反应液甩(或快速离心)至管子底部,然后立即将反应管放入荧光检测设备中。荧光检测程序设置为:恒温42 ºC;每30 s采集一次FAM通道(信号采集通道的选择与荧光探针设计一致)荧光值;反应时间20 min。

注:如使用ABI系列PCR仪,请务必于passive referencequencher处均选择“none”

体系配制

组分 体积(μL)
A Buffer 29.4
上游引物(10 μM) 2
下游引物(10 μM) 2
探针(10 μM) 0.6
ddH2O和RNA模板 13.5
B Buffer 2.5
总体积 50

注意事项:

1.  由于试剂盒灵敏度非常高,在进行反应时请注意避免微量待扩增RNA的污染,并尽量考虑设置空白对照以确认是否有待扩增RNA的污染。

2.  试剂盒保质期12个月。每次使用时,请取出实验所需的MIRA反应单元的数量,置于冰浴条件下并在8小时内使用;剩余部分,请置于存储条件下。

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