荧光型DNA恒温快速扩增试剂盒

(货号:WLE8202KIT

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【产品名称】

DNA恒温快速扩增试剂盒(荧光型)、荧光型DNA恒温快速扩增试剂盒

【原理概述】

本试剂盒基于一种常温恒温核酸快速扩增技术:在常温恒温条件下,重组酶和引物形成蛋白/单链核苷酸的复合体Rec/ssDNA,在辅助蛋白和单链结合蛋白SSB的帮助下,侵入双链DNA模板,在侵入位点形成D-loop区域,并开始对DNA双链进行扫描;待找到与引物互补的目的区域后,复合体Rec/ssDNA解体的同时,聚合酶也结合到引物的3’末端,开始链的延伸。本试剂盒在39 ºC下,依赖核酸外切酶的作用,加入根据模版设计的特异的分子探针,使用荧光监测设备能实现对目标片段扩增过程的实时监控。

【产品特点】

本试剂盒具有灵敏度高、特异性强、反应时间短(仅需20 mins)等优点,反应组分为干粉状态,操作简便,易于保存。

可适用于各种品牌的荧光定量PCR仪、恒温荧光扩增仪器等荧光检测设备,使用我公司生产的WL-1600型16孔恒温荧光检测仪效果优佳。

【引物设计】

建议使用长度在30-35 bp的引物,引物过短会影响扩增速度和检测灵敏度;引物设计避免形成二级结构而影响扩增;扩增子长度建议在150-300 bp,通常不超过500 bp。

【荧光探针设计】

探针序列不与特异性引物识别位点重叠,长度为46-52 nt,序列避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基。探针共有四个修饰位点:距离5’端的≥35 nt的中部位置标记一个dSpacer(四氢呋喃,THF),作为核酸外切酶的识别位点;THF位点的上游标记一个荧光基团,下游标记一个粹灭基团,两个基团的间距为2-4 nt;THF距离3’末端≥15 nt,并且3’末端标记一个修饰基团,例如胺基、磷酸基团或C3-Spacer。

【试剂盒组成】

组成 含量
A buffer 800 μL×1管
B buffer 150 μL×1管
正对照模板 30 μL×1管
正对照引物探针Mix 35 μL×1管
试剂 48份
使用说明书 1份

【试剂盒储存】

运输条件:低温运输;

储存条件:储存温度 ≤ -20 ºC,避光保存,避免重压、反复冻融;

产品有效期:12个月。

 

【操作步骤】

  1. 提前30分钟将试剂盒所需组分取出,室温融化,震荡混匀
  2. 每个干粉反应管加入10 μL A buffer(注意:A buffer需完全融化混匀,否则会对实验效果产生影响);
  3. 每个反应管分别加入1 μL上游引物、1 μL下游引物和4 μL探针(引物和探针浓度为10 μM,对于多个反应、步骤2和步骤3可以混合后再分装至反应管中);
  4. 向反应管中依次加入6 μL ddH2O和2 μL核酸模板(可根据核酸浓度调整加入的核酸模板体积,并相应调整加入的ddH2O体积,至模板与ddH2O总体积为5.6 μL);
  5. 最后向反应管中加入2 μL B buffer并充分混合(对于多个反应,建议将B buffer加至反应管的盖子内侧,上下颠倒反应管8-10次混匀);
  6. 混匀后,将反应液甩(或快速离心)至管子底部,然后立即将反应管放入荧光检测设备中。荧光检测程序设置为:恒温39 ºC;每30 s采集一次FAM通道(信号采集通道的选择与荧光探针设计一致)荧光值;反应时间20 mins。

注:如使用ABI系列PCR仪,请务必于passive referencequencher处均选择“none”

体系配制                             正对照荧光结果图

组分 体积(μL)
A buffer 10
上游引物(10 μM)* 1
下游引物(10 μM)* 1
探针(10 μM)* 0.4
ddH2O 和DNA模板 5.6
B buffer 2
总体积 20

*正对照反应单元体系配制:正对照模板加入2μL,引物与探针加入2.4 μL正对照引物探针Mix(已包含探针和上/下游引物),其他组分参照体系配制。

N:阴性对照; P:正对照

【注意事项】

1.  由于试剂盒灵敏度非常高,在进行反应时请注意避免微量核酸污染,并尽量考虑设置空白对照以确认是否有核酸污染。

2.  试剂盒保质期12个月。每次使用时,请取出实验所需的MIRA反应单元的数量,置于冰浴条件下并在8小时内使用;剩余部分,请置于存储条件下。

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