RNA(基础型)恒温快速扩增试剂盒-Ⅱ

RNA(基础型)恒温快速扩增试剂盒-Ⅱ                                           (货号:WLRB8207KIT

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原理概述:

本试剂盒基于一种常温恒温核酸快速扩增技术:在恒温条件下(42 °C),特殊修饰的反转录酶利用特异性引物DNA和模板RNA合成cDNA链,反应体系中的重组酶、单链DNA结合蛋白和DNA聚合酶以新合成的cDNA链为模板进行快速核酸扩增反应。适用于实验室级别的RNA扩增以及其他检测用途的RNA扩增使用。

产品特点:

本试剂盒具有灵敏度高、特异性强、反应时间短(仅需30 mins)等优点,反应组分为干粉状态,操作简便,易于保存。

本试剂对设备要求低,金属浴、水浴锅等即可进行反应操作,无需购买PCR扩增仪等价格高昂的专属设备。

引物设计:

建议使用长度在 30-35 bp的引物,引物过短会影响扩增速度和检测灵敏度;引物设计避免形成二级结构而影响扩增;扩增子长度建议在150-500 bp。

试剂盒组成:

组成 含量
A buffer 1.6 mL×1管
B buffer 150 μL×1管
试剂 48份
使用说明书 1份

试剂盒储存:

运输条件:低温运输;

储存条件:储存温度 ≤ -20 ºC,避光保存,避免重压和反复冻融;

产品有效期:14个月。

 

操作步骤:提前30分钟将试剂盒所需组分取出,室温融化,震荡混匀

1)    每个干粉反应管加入29.4 μL A buffer(注意:A buffer需完全融化混匀,否则会对实验效果产生影响);

2)    每个反应管分别加入2 μL上游引物和2 μL下游引物(引物浓度10 μM,对于多个反应、步骤1和步骤2可以混合后再分装至反应管中);

3)    向反应管中依次加入12.1 μL ddH2O和2 μL核酸模板(可根据核酸浓度调整加入的核酸模板体积,并相应调整加入的ddH2O体积,至模板与ddH2O总体积为14.1 μL;

4)    最后向反应管中加入2.5 μL B buffer并充分混合((请务必上下颠倒甩动反应管8-10次进行混匀;对于多个反应,建议将B buffer加至反应管的盖子内侧上下颠倒后混匀);

5)    混匀后,将反应液甩(或快速离心)至管子底部,然后立即将反应管放入恒温设备中42 ºC孵育30 mins;

6)    反应结束后,加入Tris饱和酚/氯仿/异戊醇(25241)抽提液,1:1混匀抽提反应液,12000 rpm离心5 mins,取5 μL上清进行琼脂糖凝胶电泳检测。(注:不建议用高温变性法去蛋白,高温变性并不能起到有效去除蛋白的效果,还是会对电泳分析产物造成影响。也不推荐用市面上销售产物纯化试剂盒对反应产物进行纯化后再电泳。很多品牌的纯化试剂盒无法达到预期效果,容易造成假阴性。

体系配制

组分 体积(μL)
A buffer 29.4
上游引物(10 μM) 2
下游引物(10 μM) 2
ddH2O和RNA模板 14.1
B buffer 2.5
总体积 50

注意事项:

1.  由于试剂盒灵敏度非常高,在进行反应时请注意避免核酸污染,并设置空白对照;

2.  使用时请取出实验所需的MIRA反应单元的数量,剩余部分请置于存储条件下。

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