分子扩增不仅仅有“PCR”,恒温扩增“MIRA”来了!!!

分子诊断技术今日不同以往,近两年确实在突飞猛进,期间恒温扩增技术由于其扩增期间不需要特殊仪器设备而更受瞩目。众所周知的恒温扩增方法有多种,例如,LAMP;RPA;RAA等。但是,今天我再给大家介绍一款更新的恒温扩增技术“MIRA”。

为了确保大家所认知的基本概念是一致的,请先了解以下名词解释

  • 重组酶聚合酶扩增技术,RPA, recombinase polymerase amplification
  • 重组酶介导的扩增技术,RAA, recombinase-aidamplification
  • 环介导等温扩增技术,LAMP,Loop-mediated isothermalamplification
  • 多酶恒温快速扩增技术,MIRA,Multienzyme Isothermal Rapid Amplification

小结解惑:

大家一定很疑惑,上述这么多种等温或恒温扩增技术。那么,哪种技术更加可靠和稳定呢?事实上任何技术都有它的优点和确定。但是,最终能否推广起来,还要看它的能否稳定量产,成本低廉以及“皮糙肉厚”(通用&适用性强)。

对此,小编就自己所知的,简单和大家分析一下。

环介导等温扩增LAMP:

    很多同道都知道LAMP起源于日本,是日本学者Notomi于2000年公布的一种新型基因诊断扩增技术。现下其技术所有权属于日本荣研化学株式会社(以下简称“荣研公司”)。

优点:灵敏度高(比传统的PCR方法高2~5个数量级);反应时间短(30~60分钟就能完成反应);临床使用不需要特殊的仪器(试剂盒研发阶段推荐用实时浊度仪);操作简单(不论是DNA还是RNA,检测步骤都是需将反应液、酶和模板混合于反应管中,置于水浴锅或恒温箱中63℃左右保温30~60分钟,肉眼观察结果)。

缺点:灵敏度高,一旦开盖容易形成气溶胶污染,无法脱离PCR实验室,否则假阳性问题比较严重。强烈推荐在进行试剂盒的研发过程中采用实时浊度仪,不要把反应后的反应管打开;引物设计要求比较高,有些疾病的基因(特别是共性序列较少/短的病毒类)不适合使用环介导等温扩增方法。应用领域相对比较窄。

RPA和RAA恒温扩增技术:

上述两种技术基本同源,除了其使用的重组酶的来源不同以外,其工作原理基本相同。

  • RPA的重组酶来源于T4噬菌体;
  • RAA的重组酶来源于细菌或者真菌。

工作原理要点:

1、在ATP存在条件下,重组酶与引物结合, 形成蛋白-核酸聚合体,并搜索配对目标;

2、当引物寻找到配对DNA模板,ATP水解供应能量,重组酶离开引物,并在DNA聚合酶的作用下合成新DNA链;

3、同时,单链DNA结合蛋白(singlestrandedDNA binding, SSB)同被置换出来的DNA单链进行结合,防止DNA模板再次形成双链。

分子扩增不仅仅有“PCR”,恒温扩增“MIRA”来了!!!

RPA工作原理图

优点:RPA/RAA整个反应非常迅速,约30min就可以得到结果;灵敏度可达10copies/ul;扩增期间不需要复杂的仪器;在此基础上开发的探针法或胶体金层析法都大大简化了检测结果的使用仪器,可以更好的满足不具备分子检测条件的基层或者经济较为落后的地区。

缺点:RPA是英国TwistDx公司开发的技术,现技术所有权为美国雅培(Abbott)故,成本极高,供货周期长,没有技术支持。很难实现国内大面积应用和量产;

       RAA纯国产技术。但是在抗干扰和成品试剂稳定性上还不是很稳定。此外,功能酶的制造工艺还有待完善,虽然推出市场已经有5年之久,但是由于稳定性和多元性的问题,尚未推广开来。

此外,RPA和RAA的扩增引物长度均要求30-35bp,太短引物会影响特异性、灵敏度和扩增速度。故设计引物有难度。

 

MIRA恒温扩增技术:

2019年中才出现的全新的常温恒温扩增技术。RPA和RAA的同源技术。

  虽然,MIRA技术和前面的RPA和RAA属于同源技术,工作原理相近。但是在酶的选种和培养、纯化等一系列的量产工艺方面和上述两种技术有很大区别。此外,作为MIRA技术的开发者“安普未来公司”技术团队在该技术上的沉淀已接近11年。已可完全应对成品试剂开发、订制开发、科研课题结题以及液体试剂等各类多元化的订制服务。

分子扩增不仅仅有“PCR”,恒温扩增“MIRA”来了!!!

MIRA工作原理图

优点:

1、MIRA试剂中的功能蛋白筛选了来源不同的各种酶,并且对某些酶进行了定点改造与修饰,使其核心功能酶体系效率更高同时体系更加完整。

2、抗干扰能力和稳定性。MIRA试剂对整个体系与辅因子的种类与浓度进行了一系列的筛选和冻干生产工艺上多方面优化,使其抗干扰能力与稳定性更强;

3、多样化和个性化。得益于所有的功能蛋白自主生产和对该技术理论的深入了解,可以使mira技术在应用上实现多样化。可以提供不同体系的试剂等,还可以根据客户的需求实现个性化的定制服务。

4.具有自主专利,不担心在后期成品研发中触及专利违规情况。100%国产技术,在今后国内乃至国际市场的竞争中具有显著优势。

  1. 已建立完整的生产Protocol。可以稳定的大批量生产。

缺点:

  1. 市场认知度还比较低,需要进一步积累在各个领域的数据和参考文献等。例如,不同领域的阳性率等参考数据。
  2. 引物设计上延续了RPA或RAA等技术的特点,需要较长的引物序列或探针序列。不太利于当下PCR用户的快速切换。
avatar

发表评论

:?: :razz: :sad: :evil: :!: :smile: :oops: :grin: :eek: :shock: :???: :cool: :lol: :mad: :twisted: :roll: :wink: :idea: :arrow: :neutral: :cry: :mrgreen: