MIRA 技术引物与胶体金探针设计原则

MIRA 技术引物与胶体金探针设计原则

 

【技术原理】

 

MIRA(Multienzyme Isothermal Rapid Amplification, MIRA)技术是一种多酶恒温核酸快速扩增技术,

 

基本原理是:在常温恒温下,重组酶和引物形成蛋白/单链核苷酸的复合体 Rec/ssDNA,在辅助蛋白和单链

结合蛋白 SSB 的帮助下,侵入双链 DNA 模板;在侵入位点形成 D-loop 区域,并开始对 DNA 双链进行扫 描;待找到与引物互补的目的区域后,复合体 Rec/ssDNA 解体的同时,聚合酶也结合到引物的 3’末端,开

 

始链的延伸,这个过程迅速高效地循环,从而完成目的片段超快速扩增。 胶体金试纸条法检测通过设计带有修饰基团的引物与探针,结合三明治夹心法核酸检测试纸条,从而

 

实现扩增产物快速检测。

 

 

 

MIRA 技术引物与胶体金探针设计原则

 

图 1:MIRA 技术原理图示

 

 

 

【引物设计】

 

建议使用长度在 30-35bp 的引物,引物过长或过短会影响扩增速度和检测灵敏度(特殊情况下设计较长 引物比较困难的序列,引物长度可缩短至 25 bp,但最好不少于 25 bp);引物序列要求:

 

1.碱基排布随机性高,GC 含量在 30%-70%之间;

2.扩增片段避免形成二级结构而影响扩增;

 

3.扩增片段长度建议在 150-300 bp,通常不超过 500 bp;

 

  1. 下游引物的 5’端标记一个修饰基团(常用生物素)。

 

 

 

【胶体金探针设计】

 

在上下游引物中间,设计一段长度为 46-52nt 与目的片段互补的序列作为胶体金探针;探针序列不与特

 

异性引物识别位点重叠,长度为 46-52 nt,序列避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基。探针共有

 

三个修饰位点:

 

  1. 5’端修饰一个抗原标记(典型 FAM);

 

2.在距 5’端约 30nt 序列位置上标记一个 dSpacer(四氢呋喃,THF),作为 nfo 的识别位点;

 

  1. THF 距离 3’末端约 15 nt,并且 3’末端标记一个修饰基团,例如胺基、磷酸基团或 C3-spacer。 

 

MIRA 技术引物与胶体金探针设计原则

 

 

图 2:MIRA 胶体金探针图示

 

 

 

【引物探针修饰示例】

 

  1. 下游引物修饰示例:

 

下游引物序列:

 

5’-CGCTGACTGCGTGCATGACCGTACCAACCG-3’

 

下游引物修饰:

 

[5’-biotin]-CGCTGACTGCGTGCATGACCGTACCAACCG-3’

 

 

 

  1. 探针修饰示例:

 

探针序列:

 

5’ATGGCTATCATATCGCATAACTGCCGACAGTAGCTCTCAAAGATGGACC-3’

 

探针修饰:

 

[5’FAM]-ATGGCTATCATATCGCATAACTGCCGACAGTAG[THF]TCTCAAAGATGGACC-[3’C3spacer]

 

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